玛丽选择的结婚对象是西班牙国王查理五世的儿子菲利普，即后来的菲利普二世。玛丽甚至对外公开宣布：“我宁愿死，也不愿意和其他的人结婚。”这桩婚姻无疑引起了大多数英国国民的担忧。首先，菲利普坚定地信仰天主教，他的宗教信仰必然会对玛丽产生重要影响;其次，英国将不可避免地被卷入西班牙和法国在欧洲大陆的争夺中。这样，害怕英国落入外国人统治之手的人士和英国国教徒遂紧紧联合起来，形成一股反对玛丽女王的强大力量。这股反对力量自然而然地将希望寄托在了信仰国教的伊丽莎白身上。由于伊丽莎白的身份，即使她不想，也必然会成为反对派的精神支柱。
玛丽也意识到了来自伊丽莎白的威胁，姐妹之情最终无法战胜现实政治利益的巨大诱惑。于是，玛丽开始逼迫伊丽莎白改信天主教。伊丽莎白表面上虽然皈依，但内心里仍然是一个新教徒，这引起了玛丽的极度不满。了解姐姐想法的伊丽莎白则更是小心谨慎，生怕授人以柄，遂向玛丽申请隐退，玛丽马上答应了这一请求。本以为退隐生活就能远离斗争中心的伊丽莎白，却又一次被无情地卷入到一场叛乱中。
1554年1月25日，托马斯·怀亚特爵士在肯特郡发动起义，反对玛丽女王。这次起义遭到镇压，但是，玛丽由此更不能容忍作为反对派精神支柱的伊丽莎白。伊丽莎白为此受到严厉的审讯和监禁，有一小段时间，伊丽莎白甚至被关入伦敦塔。面对严苛的审讯，伊丽莎白不厌其烦，一遍又一遍地否认对自己的指控，她甚至在窗户上写道：“对我多有怀疑，但无一可以证实”。面对这样的公主，玛丽一时无计可施，面对国内反对迫害伊丽莎白的呼声，玛丽不得不将其从伦敦塔中放了出来。直到今天，我们也无法得知伊丽莎白是否真的参与了这场叛乱阴谋，但是从这一事件中，却能看出她不屈不挠的坚强意志。
伊丽莎白保全了性命，但玛丽与西班牙国王菲利普二世的婚礼却使英格兰重归天主教控制的可能性增大，对此，英格兰人民，特别是上层贵族都极其不满。随着玛丽和西班牙的联姻，如许多人所料，天主教势力卷土重来。1554年11月30日，英国重新宣布为天主教国家，在玛丽的敦促下，英国议会通过了《惩治异教法》，决定用火刑来对付信奉新教的异教徒。随之而来的，是在英国发生了大屠杀，数百名异教徒被处死，玛丽也得了“血腥玛丽”的称号。
