1939年春，周恩来到皖南新四军军部，制定了“向南巩固，向东作战，向北发展”的战略方针。5月，新四军江北指挥部成立，张云逸任指挥，徐海东任副指挥，赖传珠任参谋长，统一领导新四军在长江以北部队。赖传珠协助张云逸、徐海东，领导新四军第四支队、第五支队开辟了皖东抗日根据地。陈毅、粟裕指挥黄桥战役胜利后，中央决定成立八路军华中总指挥部，叶挺任总指挥，陈毅任副总指挥、代总指挥，赖传珠任参谋长。他协助陈毅、刘少奇参与领导了苏北抗日根据地的创建。刘少奇对赖传珠的工作非常满意，说有“这么好的一位参谋长”，让他感到欣慰。 新四军在战斗中成长壮大。至1940年，即由1万人发展到10万人。国民党顽固派对新四军的发展感到恐惧，千方百计要消灭新四军。
1941年1月，蒋介石以7个师的兵力，围歼遵命北移的新四军军部和直属部队，制造了震惊中外的“皖南事变”，并宣布取消新四军番号。为打退国民党顽固派的猖狂进攻，中共中央、中央军委决定重建新四军军部，任命陈毅为新四军代军长，刘少奇任政委，张云逸任副军长，赖传珠任参谋长，邓子恢任政治部主任。1月25日，新的军部在江苏盐城召开成立大会，陈毅发表就职演说，赖传珠也在会上讲话，申明我军立场。次日，赖传珠制订了部队整编计划，并致电中央：“拟将新四军改编为4个师。”中央研究后，决定新四军下辖7个师、1个独立旅，9万余人。赖传珠根据各部队所处战斗地域，重新划分各部队的战略区，经陈毅、刘少奇、张云逸审定，中央军委批准，正式划分了各战略区，并确定了各部队主官：苏中为第一师，师长粟裕，政委刘炎；淮南为第二师，师长张云逸兼，政委郑位三，副师长罗炳辉；苏北为第三师，师长兼政委黄克诚；淮北为第四师，师长兼政委彭雪枫；鄂豫边为第五师，师长兼政委李先念；苏南为第六师，师长兼政委谭震林；皖江为第七师，师长张鼎丞，政委曾希圣；淮区和鲁南结合部为军独立旅，旅长梁兴初。
