1921年11月，陈独秀由广州回到上海，开始担任中央的日常工作。陈长璞说，在爷爷签发的第一份通告上首次用陈独秀的英文缩写“T. S. chen”签名。
1922年7月16日，中共第二次代表大会在上海召开。陈独秀被选为中央执行委员会委员长。同年9月，中央的机关刊物《向导》创刊，陈独秀任主编。共产国际代表马林建议国共合作。之后，陈独秀同李大钊等人参加了国民党，即史称“第一次国共合作”。1923年6月12日，中共第三次代表大会在广州举行。在会上正式承认了国共合作，***进入中央局。“三大”会议上，根据《中央委员会组织法》，陈独秀被再次选为中央执行委员会委员长，***为秘书。“三大”之后，在中央签发的许多文件上有委员长陈独秀和秘书***的签名。
1925年1月，中共第四次代表大会在上海举行。陈独秀被选为中央局总书记兼组织部主任。10月，陈独秀出席了在北京召开的中央委员会扩大会议。
1927年4月27日，中央第五次代表大会在武汉召开。陈独秀被选为党的总书记。在会上，陈独秀的长子陈延年、次子陈乔年同时被选为中央委员。陈延年同时被选为政治局候补委员。
1927年大革命失败后，陈延年、陈乔年相继被国民党杀害。陈延年和陈乔年于1922年6月至1923年先后赴法国勤工俭学和赴莫斯科东方大学学习。陈延年曾先后任中共广东区委组织部长、区委书记，中共江浙区委书记，江苏省委书记，1927年6月29日牺牲时，年仅29岁。陈乔年先后任中共北京地委组织部长、北方区委组织部长，中共湖北省委书记，中共中央组织部副部长，中共江苏省委组织部长等职。1928年1月19日牺牲时，年仅26岁。大半年时间内，陈独秀痛失两个爱子，身心受到巨大摧残。
陈独秀曾经对濮清泉（濮德治）说：第五次代表大会，自己成为众矢之的，大家骂我是“右倾”机会主义、投降主义，我投降了哪个？蒋介石把延年、乔年都杀了，我投降他吗？汪精卫高唱：“革命的到左边来，不革命的滚开去。”不仅我以为他是“左派”，连斯大林也认为他是“左派”。1929年11月5日，陈独秀被开除党籍。在这期间，陈独秀逐渐接受了苏联托洛茨基的观点，对共产国际的独裁专制颇为不满，办刊物、写文章声明中国的问题应该由中国人自己研究解决。
